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InstantPCR芯片

1. PCR芯片V2.0简介

境象生物表达谱PCR芯片V2.0有96孔和384孔两种规格，可以同时对几十到几百个与某一主题相关的基因、miRNA、lncRNA进行表达谱分析。产品采用SYBR实时荧光PCR方法。以96孔PCR芯片为例，基因专一性引物已分别固定在96孔PCR芯片中。您只需要将反转录反应产生的cDNA与PCR master mix混合，再将混合物分配到PCR板的96个孔位，进行实时荧光PCR反应，您就能轻松获得88个相关基因的表达情况。应用两块96孔PCR芯片分别对实验样品和参照样品进行分析，您就能对88个基因的表达进行相对定量。

PCR芯片1.0和2.0的区别

PCR芯片1.0 PCR芯片2.0
主题更丰富 基因表达谱 基因、miRNA、lncRNA、环状RNA表达谱
应用更广泛 基因表达定量 基因表达、miRNA分析、靶向测序文库构建等
布局更合理 88个目标基因，6个看家基因，1个PCR阳性对照，1个基因组对照 减少1个看家基因，加入了反转录质控（反转录质控性能验证数据见6.1 c）
程序更优化 罗氏480运行时间约2小时 罗氏480运行时间1小时
数据分析更全面 仅提供基因表达差异倍数 提供数据质控、基因表达差异倍数、散点图等

2. PCR芯片的用途

3. 境象生物PCR芯片的优越性

聚焦主题 按主题选择几十到几百个基因，聚焦您的研究主题。
境象生物提供近150种主题的PCR芯片现货产品，参见现货产品目录；您也可以根据需要定制您感兴趣的主题PCR芯片。
操作便捷 只需混合PCR Master Mix、cDNA 及ddH2O并分配上板，仅用5分钟手动时间，真正为研究者带来方便。
结果可靠 引物经过精心设计，产品经过反复验证，生产质检严格控制，数据分析细致严谨。
反应迅速 国内唯一一家自主研发PCR芯片的厂家，现货1周发货，定制2-4周发货，芯片服务可在一个月内完成。

4. 境象生物PCR芯片的引物设计优越性

5. 境象生物PCR芯片的性能验证资料

a) PCR芯片性能优势：阳性信号率高

使用总量为500ng ~ 2μg的RNA进行反转录，得到的cDNA稀释3~5倍后平均分配到PCR芯片孔位中，通过阳性信号率（可检测到的基因占总目的基因的比例）来检测PCR芯片灵敏度。表1和表2显示：提供检测数据的24位客户，使用不同主题PCR芯片，平均阳性信号率（percentage of positive calls，以Ct < 38为基准）大于90%。

b) PCR芯片性能优势：重复性好

1） PCR阳性对照（PPC）： PPC孔位中包含与所检测物种无同源性、人为设计的DNA片段，同时加入扩增该DNA片段所需的引物。实验结果显示：对客户定制主题PCR芯片进行检测，72次独立实验PPC的Ct值均集中在26.74±0.47。表明PCR芯片在各个独立实验间的重复性准确可靠。

2） 技术重复：实验样本为6个正常样本（正常组）和6个实验样本（实验组），每样本测定2组基因，每个基因三次技术重复（每板96孔PCR芯片共检测96个基因，两组PCR芯片共检测192个基因）。结果显示：12个样本、192个基因技术重复的Ct值变异系数在6.3%以下，Tm值变异系数在1.85%以下。

c）PCR芯片性能优势：线性关系好

使用1pg ~ 1μg 7个梯度稀释的人类脱落细胞样本样本总RNA，稀释后分别加入0.8pg RTC。用表3列出的15个基因（含RTC）的专一性引物分别进行检测，每组3次重复，结果显示：基因专一性引物扩增线性关系良好（注：低浓度时出现无扩增或部分Tm值不符，不计入统计）。上述实验表明：境象生物反转录体系及PCR体系工作性能稳定，在不同基因中扩增性能良好，线性关系良好 ；RTC加入量一定时，其Ct值与总RNA量不相关。

d) PCR芯片性能优势：扩增效率高

6. PCR芯片如何进行质控

6.1 境象生物PCR芯片上质控设置

a) PCR正对照（PPC）

PPC孔位中包含与所检测物种无同源性、人为设计的DNA片段，同时加入扩增该DNA片段所需的引物，有两个作用：一是用于质控PCR反应体系：正常PPC扩增Ct值稳定，过高则说明PCR体系有问题，或样本中含有PCR抑制剂；二是作为批间质控指标：PPC扩增Ct值的重复性可作为批间差指标之一。

对客户定制主题PCR芯片进行检测，72块PCR芯片的PPC的Ct值均集中在26.74±0.47。表明PCR芯片在各个独立实验间的重复性准确可靠。

b) 基因组对照（GDC）

GDC孔位中包含一对PCR引物，扩增一个特定的基因组非编码区域，用于检测PCR体系中残余的基因组DNA。境象生物 PCR芯片操作步骤中，设置了DNA酶消化步骤，以尽量避免RNA样本中残留的基因组DNA对结果的影响。同时，境象生物PCR芯片绝大多数引物设计跨越内含子或外显子与内含子交界处，只扩增成熟mRNA。如果客户因为种种原因（如RNA样本很少，或无高质量的DNA酶）而无法进行DNA酶消化步骤，依然可以使用境象生物PCR芯片，大多数情况下基因组DNA对结果几乎无影响；但是对于没有跨越内含子或外显子与内含子交界处的孔位，数据不可用。

c) 反转录对照（RTC）

境象生物主题PCR芯片V2.0加入了反转录对照（RTC），用于质控RNA反转录效率。反转录对照是一条人工合成的RNA链，已包含在境象生物反转录试剂盒中（货号：CTB101）。注：使用境象生物V2.0 PCR芯片时建议使用境象生物反转录试剂盒（货号：CTB101），如果没有使用境象生物反转录试剂盒，PCR芯片依然可用，但RTC孔位扩增数据不可作为反转录质控。

RTC性能验证资料

1）RTC 线性关系：将人工合成的RTC进行梯度稀释后，分别加入到1ug 人类脱落细胞样本总RNA中，应用境象生物一步法RT-PCR试剂盒（货号：CTB105）和RTC专一性引物进行一步法RT-PCR检测，结果显示：RTC在800pg~0.0008pg范围内线性关系良好, R²=0.9941。

2）RTC在不同样本中的重复性：将人工合成的RTC进行梯度稀释后，分别加入到1ug不同物种不同类型样本的总RNA中，用RTC专一性引物进行检测。每个梯度加入5个不同样本，结果显示： RTC在0.008pg~8pg范围内，在不同样本中Ct值重复性好（CV＜2%）；各浓度的Ct值平均值线性关系良好，R²=0.9992。

3）RTC对靶基因扩增的影响：将空白对照（ddH2O），0.08pg、0.8pg、8pg RTC 分别加入到1ug人类脱落细胞样本总RNA中，用表3列出的14个基因的专一性引物分别进行检测，每组3次重复，即每个基因共计检测12次。结果显示：与空白对照相比，各浓度梯度RTC对靶基因扩增均无影响。

d) 参比基因设置

每一块96孔PCR芯片V2.0设有5个参比基因（看家基因）对照，以方便您选择在您的实验或生理条件下稳定表达的参比基因，用于基因表达相对定量。境象生物数据分析时，如果5个看家基因表达均正常，则使用5个看家基因的Ct值平均值，如果某些看家基因Ct值不稳定，则首先选择在所有样本中稳定表达的看家基因作为数据分析基础。

6.2 数据分析质控

独创的Tm置信区间数据库：境象生物建立了引物数据库，通过大量客户服务累积的数据，针对每个引物统计出其每次扩增产物的Tm值，通过统计学算法计算出每个Tm值的置信区间。境象生物在进行数据分析时，将PCR结果Tm值与置信区间比较，若某次实验Tm值不在置信区间内，系统将会提示数据不可靠。

下图A为境象生物引物数据库中2000多对引物扩增产物的Tm值置信区间；图B为人CCL2基因在不同时间、不同批次进行的121次实验的Tm值，根据历次Tm值确定该引物扩增片段Tm值置信区间为81.51~82.18，121次实验中仅有4次实验超出该置信区间，Tm值非常稳定。

7. PCR芯片适配仪器

我们将根据您实验室的实时荧光定量PCR仪型号提供相应规格的PCR芯片。已检测机型：

8. PCR芯片的实验操作流程

9. 现货和定制PCR芯片中的基因选择依据

境象生物每一个主题芯片都参考了全球各大权威生物信息数据库，同时结合相关领域文献报道，精心挑选与主题相关的基因。我们也征求专家意见和聆听用户反馈，根据实际需要修改其中的基因。

为境象生物提供信息支持的数据库有：

10. 如何定制芯片

我们根据客户需要生产定制PCR芯片。您可以通过以下方式定制芯片：

1) 在目录产品的基础上更换您感兴趣的基因。

2) 根据您感兴趣的主题和需求，我们为您从头设计PCR芯片。


定制芯片的流程如下：

a) 确定PCR芯片主题，样品物种；

b) 选择PCR芯片格式，提供各种PCR芯片定制格式类型，例如：

注：定制PCR芯片从12板开始起订。

11. PCR芯片服务提供哪些实验结果

我们为您提供以下4类分析结果：

a) PCR芯片目标基因和检测转录本情况列表，例如：

b) 实验结果图片（扩增曲线和熔解曲线），例如：

c) 数据结果分析报告，例如：

d) 数据分析图片，例如：